近些年，藻類水華事件常有報(bào)道.其中，硅藻水華自1992年春季在我國漢江下游爆發(fā)后，幾乎每年春季漢江中下游江段均會暴發(fā)不同程度的水華.2005—2011年，嘉陵江流域間斷性爆發(fā)硅藻水華，70%~80%的藻類屬于針桿藻，水體渾濁，溶解氧降低，對水源質(zhì)量造成了巨大的破壞;且水廠出現(xiàn)硅藻嚴(yán)重堵塞濾池的現(xiàn)象，導(dǎo)致水處理量減小，出廠水質(zhì)變差.
目前除了常規(guī)的物理除藻方法，研究最多的是化學(xué)控藻技術(shù).Daly等研究銅綠微囊藻最高細(xì)胞密度為30×104 cells · mL-1時，氯作用在7～29 mg · min · L-1 之間(在水廠正常的消毒劑量范圍內(nèi))，所有藻細(xì)胞失活;但是已經(jīng)有大量的研究證明氯法殺藻會引起水中三鹵甲烷(THMs)等消毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此該方法已經(jīng)正在逐漸被其他除藻藥劑代替.Chen等研究了高錳酸鉀預(yù)氧化能很好提高絮凝對藻去除率的機(jī)理，而Petrusěvski 等的研究也指出高錳酸鹽的使用劑量與殘余錳量是呈正相關(guān)的，因此發(fā)生水華時投加高錳酸鹽很有可能會造成水源中錳超標(biāo)，硫酸銅的使用也有此類問題.劉海龍等用1.0 mg · L-1的臭氧預(yù)氧化使藻的去除率從常規(guī)混凝沉淀后水的55%~85%上升到95%左右，但高投加量(≥2.0 mg · L-1)的預(yù)氧化，會影響有機(jī)物的去除;Coral等研究直接使用臭氧作用于細(xì)胞密度為25×104和150×104 cells · mL-1 的銅綠微囊藻藻液，在作用CT值都小于0.2 mg · min · L-1 時，所有細(xì)胞即失活;可看出臭氧除藻的效果很好，但是存在的問題是制備臭氧的設(shè)備成本很高，在國內(nèi)很難應(yīng)用于實(shí)踐.Huang等從劑量、接觸時間和pH值等方面研究表明二氧化氯對藻的去除效果優(yōu)于或等同于液氯的去除效果;Zhou等研究將二氧化氯直接作用細(xì)胞密度為100×104 cells · mL-1銅綠微囊藻，在二氧化氯濃度1.0 mg · L-1作用10 min，藻細(xì)胞去除率達(dá)到91.5%.
目前我國關(guān)于除藻技術(shù)的研究以藍(lán)藻為主，較少有硅藻殺滅的研究，因此本文以硅藻門中的針桿藻為例，利用大氣壓強(qiáng)電離放電高效生成的· OH，注入到處理高藻水的主管路中，進(jìn)行水華典型藻針桿藻的殺滅研究.采用以SYTOX Green熒光染色結(jié)合熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測藻細(xì)胞活性、光合活性參數(shù)Fv/Fm值分析藻細(xì)胞光合能力，這3種方法來確定· OH致死針桿藻的閾值濃度和閾值濃度下的致死時間.
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
藻種及培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)所用的藻種購自中科院武漢水生所.針桿藻(FACHB-843，Synedra sp.)：屬硅藻門羽紋綱無殼縫目，細(xì)胞長桿形，長10 μm左右，殼面披針形，中部寬，從中間到兩端逐漸狹窄;色素體帶狀，位于細(xì)胞的兩側(cè)、片狀，2個，每個色素體常具有3個到多個蛋白核.培養(yǎng)基為Erdschreiber，培養(yǎng)條件為(25±1)℃，pH=7.0±0.1，光照2000 lx，光期 ∶ 暗期=12 ∶ 12.利用顯微鏡計(jì)數(shù)對藻細(xì)胞密度進(jìn)行監(jiān)測，同時測吸光度，待進(jìn)入對數(shù)生長期，進(jìn)行實(shí)驗(yàn).
實(shí)驗(yàn)用水是由純水機(jī)制備的去離子水，用于調(diào)節(jié)系統(tǒng)參數(shù)制備所需濃度的TRO溶液和配制藻液.
2.2 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)
· OH處理高藻水的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)如圖 1所示.待處理藻液由水泵泵入管路，進(jìn)水流量為4 L · min2-1，純度為99.9%的O2通入氧等離子體發(fā)生器中(圖 2)，流量為0.5 L · min-1.在大氣壓下微流注與微輝光交替協(xié)同形成的強(qiáng)電離放電作用下，O2被電離，生成O+、O(21D)、O、O-、O2(a21Δg)、O3等氧活性粒子;然后在高壓射流器處，經(jīng)射流、空穴作用將氣態(tài)氧活性粒子高效傳質(zhì)混溶于水溶液中，生成以· OH為主的氧自由基溶液，其中還包括H2O2、HO-、O2· -，
圖1 · OH處理高藻水的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)
圖2 等離子體發(fā)生器構(gòu)造圖
O2· -、HO3 ·和O2+H2O等自由基，將這些氧自由基統(tǒng)稱為總氧化劑TRO，使用在線檢測儀(ATi Q45H，美國)對管路中的TRO濃度進(jìn)行測定.TRO溶液在管路中作用于藻細(xì)胞，進(jìn)行快速高效地殺滅.管路中設(shè)置不同的取樣點(diǎn)，作用時間分別為1、2、3、4、5、6 s，以研究不同作用時間的殺滅效果.
2.3 檢測方法
2.3.1 總氧化劑TRO(Total
reactive oxidant)濃度檢測 TRO是以· OH為主，包括H2O2、HO2-、O23· -、O· -、HO3 ·和O2+H2O等氧自由基的總氧化劑，使用在線監(jiān)測儀(ATi Q45H，美國)對TRO濃度進(jìn)行測定，同時使用DPD(N，N-二乙基對苯二胺)分光光度法對濃度進(jìn)行校正，該方法根據(jù)USEPA標(biāo)準(zhǔn)330.5建立，使用紫外可見分光光度儀(Bioquest CE2501，英國)測定.
2.3.2 藻細(xì)胞活性分析
本實(shí)驗(yàn)采用熒光染色法結(jié)合熒光顯微鏡計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀來定量分析藻細(xì)胞活性，這些方法已廣泛應(yīng)用于分析細(xì)菌、胞子和藻細(xì)胞活性.熒光染料為SYTOX Green(Life Technologies，美國)核酸染色劑，當(dāng)細(xì)胞膜受損，染色劑通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，與DNA結(jié)合，可在488 nm波長激發(fā)后發(fā)出綠色熒光;對于活細(xì)胞，染色劑不能通過細(xì)胞膜而不會被染色.
于暗室內(nèi)染色，使用熒光顯微鏡(Nikon 90i，日本)和0.100 mL 100格的藻類計(jì)數(shù)框(20 mm×20 mm)，進(jìn)行觀察計(jì)數(shù).涂片靜置，放大400倍，分別在自然光和藍(lán)色激發(fā)光下觀察細(xì)胞，對沒有發(fā)出綠色熒光的完整細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).以1行(即10格)為1個計(jì)數(shù)單位進(jìn)行計(jì)數(shù)，所計(jì)細(xì)胞數(shù)目≥100 cells.
于暗室內(nèi)染色，樣品經(jīng)流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter Gallios，美國)488 nm的波長激發(fā)，細(xì)胞發(fā)出的熒光信號會分別被FL1(525 nm)和FL3(620 nm)通道收集.激發(fā)后發(fā)出的綠色熒光，在FL1通道被收集;同時細(xì)胞內(nèi)葉綠素發(fā)出的紅色熒光會被FL3通道收集.
2.3.3 藻細(xì)胞的光合能力分析
光合參數(shù)Fv/Fm值，表示藻細(xì)胞光合反應(yīng)中心PS II的最大光量子產(chǎn)量，反映了植物的最大潛在光合能力.該值越大說明光和潛力越大.樣品經(jīng)10 min的暗適應(yīng)，使用浮游植物熒光儀(PHYTO-PAM Walz，德國)和Photo win v2.13(ED)操作軟件測定.經(jīng)過充分暗適應(yīng)后，所有電子門均處于開放態(tài)，打開測量光得到最小熒光F0，此時給出一個飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱，此時得到的最大熒光Fm，根據(jù)Fm和F0可以計(jì)算出Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm.
3 結(jié)果與分析 3.1 采用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)確定致死閾值
實(shí)驗(yàn)中對初始藻密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的藻液在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中進(jìn)行殺滅.對于某一藻密度的藻液，改變TRO濃度，利用熒光顯微鏡測定藻細(xì)胞的存活率(c/c0).得到不同初始藻密度的藻細(xì)胞存活率與TRO濃度的關(guān)系曲線，如圖 3所示.可看出，隨著TRO濃度的不斷升高，藻細(xì)胞存活率隨之降低;在相同的TRO濃度下，藻類的初始濃度越高，存活率越低.因此使不同的初始藻密度的藻細(xì)胞完全致死所需的TRO濃度是不同的.隨著藻液初始藻密度的升高，所需要的致死劑量也隨之升高.致死劑量由低到高分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1.
圖3 藻細(xì)胞存活率(c/c0)與TRO濃度的關(guān)系曲線
分析比較初始密度增大的倍數(shù)與對應(yīng)的TRO致死劑量增大的倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)TRO致死劑量增大的倍數(shù)均小于初始密度增大的倍數(shù).如初始藻密度10×104 cells · mL-1分別增大到5、10倍，而對應(yīng)的TRO致死劑量明顯小于5、10倍.推測溶液中· OH占總氧化劑的比例隨TRO濃度的增加而增加，從而導(dǎo)致所需的TRO劑量相對減少.
初始藻密度為100×104 cells · mL-1的藻液，在致死閾值下經(jīng)· OH處理.在顯微鏡下，放大400倍，分析處理前后藻細(xì)胞形態(tài)的變化.在自然光下，處理前，藻細(xì)胞通體周圓，細(xì)胞壁光滑完好，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分布清晰，顏色鮮亮稠密;處理后，藻細(xì)胞外形基本沒有變化，但顏色暗淡，胞內(nèi)分布模糊.在熒光下，處理前藻細(xì)胞發(fā)出紅色的葉綠素自體熒光，無綠色熒光;處理后細(xì)胞核發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，證明細(xì)胞失活，染色劑通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，使細(xì)胞核染色.
以上現(xiàn)象均可看出在較低的致死閾值作用下，細(xì)胞失活后外形沒有大的變化，更沒有出現(xiàn)裂解.
3.2 采用光合能力確定致死閾值
作為一種自養(yǎng)型生物，硅藻需要自身的光合反應(yīng)系統(tǒng)，包括光合反應(yīng)系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光合反應(yīng)系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)完成能量轉(zhuǎn)換.這種脈沖式調(diào)制熒光測定技術(shù)(PAM)是基于測定葉綠素?zé)晒獾脑?，是一種表征光合反應(yīng)系統(tǒng)的性能，特別是PSⅡ的活性的強(qiáng)有力的手段.對PSⅡ反應(yīng)中心的損傷不僅會引起光抑制作用，固碳作用受損和生長速率降低.目前已有研究表明利用該方法測得的Fv/Fm值可作為預(yù)測藻類生長趨勢的參數(shù).
初始細(xì)胞密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的藻液，測定經(jīng)過不同TRO濃度作用后藻液的光合參數(shù)Fv/Fm值，分析藻細(xì)胞光合能力的變化情況，處理前藻液的Fv/Fm值為0.50左右，處理后隨著TRO濃度的增大而減小，F(xiàn)v/Fm值降低為0，說明此時的藻細(xì)胞已經(jīng)不能進(jìn)行光合作用，藻細(xì)胞已無生長能力.此時的TRO濃度即為致死閾值，分別為0.30、0.75、1.20 mg · L-1.
3.3 采用流式細(xì)胞技術(shù)確定致死閾值濃度
初始藻密度為100×104cells · mL-1，利用流式細(xì)胞儀分析不同TRO濃度與藻細(xì)胞致死情況的關(guān)系，橫坐標(biāo)FL1-A對應(yīng)于染色劑與細(xì)胞核酸結(jié)合后發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)FL3-A對應(yīng)于葉綠素的自發(fā)紅色熒光強(qiáng)度.區(qū)域Q1的FL1信號較弱，而FL3信號較強(qiáng)，說明此區(qū)域?yàn)榛罴?xì)胞所在區(qū)域.比較對照組和處理組，細(xì)胞團(tuán)由區(qū)域Q1逐漸向右下方即區(qū)域Q2和Q3移動，即綠色熒光增強(qiáng)，葉綠素?zé)晒鉁p弱.證明細(xì)胞失活，被SYTOX Green染色，同時葉綠素也遭到破壞.由對照組到TRO濃度依次增大為0.61、0.83、1.18 mg · L-1，區(qū)域Q1的活細(xì)胞占全部檢測細(xì)胞的比例由原始的93.6%依次減小為16.5%、1.21%、0.265%(圖 4a~d)，說明存活細(xì)胞隨TRO濃度的增大而減少.
3.4 · OH對針桿藻的致死時間探究
分別在致死閾值濃度0.30、0.75、1.20 mg · L-1時，將初始藻密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的針桿藻藻液通入殺藻實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(圖 1).將高壓射流器處藻液與氧等離子體剛開始混合時，設(shè)為0 s，分別依次于不同作用時間(分別為1、2、3、4、5、6 s)的取樣口取樣，同時用過量的飽和硫代硫酸鈉終止反應(yīng).檢測每一樣品的Fv/Fm值，結(jié)果可看出，F(xiàn)v/Fm值均在1 s內(nèi)快速由0.50減小為0(儀器顯示為不能檢出).說明在高壓射流器處到1 s取樣口之間，發(fā)生了氧等離子體與水分子快速生成· OH并進(jìn)行劇烈的生化反應(yīng).
3.5 討論
3.5.1 致死閾值的確定
分析3種確定致死閾值的方法，可知用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)比較直觀，可得到細(xì)胞存活數(shù)量，得到的結(jié)果比較穩(wěn)定可靠，致死閾值分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1;而通過光合參數(shù)Fv/Fm值的變化確定的致死閾值(0.30、0.75、1.20 mg · L-1)與顯微鏡計(jì)數(shù)確定的致死閾值相差很小，分別為0.05、0.04、0.02 mg · L-1，基本吻合;采用流式細(xì)胞儀分析處理前后不同通道接收的熒光強(qiáng)度的變化來確定致死閾值，這種方法存在的問題是，只能得到活細(xì)胞的百分比例，無法得知具體的數(shù)目，而且結(jié)果的準(zhǔn)確度與分析者的熟練程度有很大關(guān)系.本實(shí)驗(yàn)中初始藻密度為100×104 cells · mL-1，在致死閾值1.18 mg · L-1下，使用流式細(xì)胞儀分析后，仍有約2560 cells · mL-1的活細(xì)胞，由于實(shí)驗(yàn)分析方法的局限，無法使致死率達(dá)到100%，因此該方法確定的致死閾值要大于使用計(jì)數(shù)法確定的致死閾值.
3.5.2 ·
OH對針桿藻的殺滅效果 本實(shí)驗(yàn)中在致死閾值下，1 s內(nèi)使光合參數(shù)Fv/Fm由0.50減小為0，使100×104cells · mL-1藻液中的藻細(xì)胞失活的CT值約為0.02 mg · min · L-1，Li等(Li et al.， 2014)的研究水力空化作用1 min，產(chǎn)生· OH的濃度為(0.67±0.03)μmol · L-1，立即測定光合參數(shù)由0.33降低為0.31，變化很小;Ou等的研究結(jié)果為KMnO4作用2 h，光和潛力由0.45減低到0.07;Zhou等的研究結(jié)果為2.5 μmol · L-1(即0.4 mg · L-1)CuSO4及0.5 mmol · L-1(即17 mg · L-1)H2O2分別作用48 h后，光合參數(shù)分別由處理前約0.42減小為約0.05.Daly等利用流式細(xì)胞儀來定量分析氯對藻細(xì)胞的致死率，研究中也發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞數(shù)量增多，致死率達(dá)100%時的需氯量也隨之增加;氯作用的CT值在7 mg · min · L-1以上，可使30×104 cells · mL-1的銅綠微囊藻藻細(xì)胞完全致死;Zhou等的研究中發(fā)現(xiàn)可使100×104 cells · mL-1的銅綠微囊藻藻細(xì)胞在1 mg · L-1的二氧化氯作用10 min后(CT值約為10 mg · min · L-1)致死率達(dá)到91.5%.相比之下，本實(shí)驗(yàn)條件下得到的反應(yīng)時間是其他普通氧化劑的1/60以下，CT值為其他氧化劑的1/100以下，說明· OH有強(qiáng)烈的氧化性和極高的氧化反應(yīng)速率，其氧化還原電位(2.8 V)接近氟的氧化還原電位，反應(yīng)無選擇性;而且反應(yīng)速率高達(dá)109 mol · L-1 · s-1，比其他氧化劑的高107倍，可使生化反應(yīng)在ms級內(nèi)進(jìn)行.
4 結(jié)論
1)初始藻密度分別為10×104、50×104和100×104 cells · mL-1的藻液，采用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)和光合能力的變化確定的致死閾值分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1及0.30、0.75、1.20 mg · L-1，分別相差0.05、0.04、0.02 mg · L-1，基本吻合.而采用流式細(xì)胞儀分析確定致死閾值時，無法使致死率達(dá)到100%，因此無法確定致死閾值.
2)在致死閾值下，光合參數(shù)Fv/Fm值1 s內(nèi)減小為0，藻細(xì)胞喪失光合能力和生長潛力.
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